广东快速qPCR仪使用说明

在扩增曲线上，指定某个荧光强度值时可对应得到达到这个值所需的循环数。选择合适的荧光强度值，该值的水平线可以切割到所有处于指数增长期的扩增曲线，这样的荧光强度值称为荧光阈值（threshold）。在荧光进入指数期初阶段的荧光强度值符合这一特点。一般PCR扩增的初始循环（默认3~15个循环），荧光信号变化不大，接近直线，称为基线（baseline），所以通常仪器默认的阈值是PCR反应~15个循环（荧光本底信号）的荧光信号标准偏差的10倍。当然，实际还需要结合PCR扩增效率、线性回归系数等综合考虑。也可以将阈值手动设置为大于荧光背景值和阴性对照（NTC）的荧光比较高值之间（进入指数期的初阶段）。qPCR目的PCR监测目标DNA分子扩增，PCR产物实时检测使用DNA结合染料和荧光PCR引物或探针两种方法来实现。广东快速qPCR仪使用说明

1983年，美国化学家Kary Mullis发明了聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction， PCR)，这一技术将DNA聚合酶的特性结合核酸双链的变性复性特性，采用适温延伸、高温变性以及低温复性，让目的核酸片段实现了特异性体外扩增，可将极微量的目标DNA特异地扩增上百万倍，从而提高对DNA分子的分析和检测灵敏度。尤其是耐热DNA聚合酶的发现，更是极大地促进了PCR技术在分子生物学科研，及临床分子诊断领域的广泛应用。常用的 PCR 技术包括逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）和实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）等。珠三角准确qPCR仪报价PCR 反应中通过控制温度变化使得核酸分子重复地解链与延伸，从而实现对目的片段的指数扩增。

qPCR中的荧光探针是一种短链寡核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团，它可以特异结合目的产物的DNA序列。其检测原理是荧光共振能量转移（FRET），即荧光基团和淬灭基团在目标DNA分子扩增过程中因为聚合酶的外切活性从而水解分离使荧光信号的释放；随着扩增过程的推进，机器实时检测增强的荧光信号，从而产生终的荧光扩增曲线。根据修饰基团标记和能量转移方式，可以将探针分为TaqMan探针、分子信标和其他探针。TaqMan探针（荧光淬灭水解探针）现今常用的TaqMan探针主要是水解探针，其多是5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团的短单链寡聚核苷酸。在qPCR反应中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，对TaqMan探针进行切割，使荧光基团和猝灭基团分离，荧光基团发出的荧光信号不会被淬灭，释放的荧光信号被机器接收。TaqMan探针的qPCR相比于染料法多了一条TaqMan探针，可以特异性结合DNA序列，因而具有更好的特异性，但探针合成价格偏高。

Quantagene q225 系列荧光定量PCR 系统主要特点：精确定量 以可靠的数据助力您的研究。采用拟合算法计算 Ct 值，定量误差不超过±10%。液体冷却循环系统确保孔间温度高度一致，温差不超过 ±0.15°C。光学系统无运动部件，稳定性增加，长期使用无需校准与维护。的仪器间重复性，不同位置、不同反应体积均不影响定量结果。快速高效 用更短的时间获得更多数据。40 个循环的常规 qPCR 只需43 分钟，较常见qPCR 仪多缩短60% 的时间。在提高速度的同时保持了96 孔的高通量，满足绝大多数实验需求。小巧轻便 节省空间及您的宝贵样品小体积为移动实验和大量部署提供可能。5-10 μl 的推荐反应体积，较常规实验节省80%的试剂用量，更节约您的珍贵样品。SYBR Green是一种DNA插入染料用于qPCR。虽然SYBR Green方法比探针方法便宜，但是特异性没有荧光探针方法好。

染色质片段化——DN段化:细胞核材料片段化是获得良好的ChIP 分辨率的关键因素，理想情况下的片段大小在 200 到 800 bp对之间。剪切是难控制的步骤之一。通过超声处理和/或核酸酶/酶促消化可以实现剪切，各有利弊。超声处理需要大量的手动操作时间，但非常适合难以裂解的细胞；酶促消化不需要手动操作，适用于大量样品的处理，但其剪切位点不是随机的。两种方法都需要根据具体细胞系进行优化。注意：此时可以停止ChIP。经过剪切/消化染色质后，可以将样品于-80°C储存。避免反复冻融。实时荧光定量PCR指在PCR反应体系加入荧光基团，荧光信号实时监测PCR,通过标准曲线对未知模板进行定量分析.佛山单通道qPCR仪

实时荧光定量PCR技术有效解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。广东快速qPCR仪使用说明

相对定量实验方法包括两种重要方法：ΔΔCT Method：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因。内参基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。定量需要由标准曲线建立Ct值跟拷贝数之间的关系，标准曲线由标准品生成，标准品可以是已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成，定量未知模板时标准样品和未知样品必须同时反应。广东快速qPCR仪使用说明

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