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外泌体研究常见问题解答83.外泌体是如何可视化和/或计数的？外泌体太小（30–150nm），无法使用常规显微镜观察，因为这于大小至少为几微米的物体。光学显微镜的分辨率太低，无法观察外泌体。外泌体大小分布的典型分析方法包括纳米粒子跟踪分析（NTA）、纳米流式和电子显微镜。尽管在方法上非常不同，但这些技术都允许你研究尺寸低至10纳米的纳米颗粒。要确定样本中外泌体的浓度，可以使用NTA、纳米流式。它们通过不同的原理对纳米颗粒（10–1000nm）进行计数和粒径测定。NTA可能是获得溶液中颗粒平均尺寸和浓度信息的常用方法。然而，这种方法无法区分大小相同的囊泡和蛋白质聚集体。因此，我们建议将这种方法与显微镜技术相结合，以验证膜的存在。4.外泌体电镜是不是一定要有膜结构，无膜结构的球体是外泌体吗？负染电镜结果中外泌体的形态肯定是那种明显的茶托样或者大饼样的！边缘有一圈略微更明亮的亮圈。如果你打到的结构是没有膜结构的圆球形，那么您很可能看到了脂蛋白颗粒或者抱团的蛋白质。外泌体研究工具定制化检测方案，准确匹配研究需求，避免功能浪费。工程化外泌体供应商

外泌体研究常见问题解答91.外泌体的分离方法有哪些，哪种更好？分离是进行外泌体研究关键的一步，只有选择了合适的方法才能得到理想的实验结果。分离方法包括：超速离心、尺寸排阻、免疫磁珠、聚合物沉淀、亲和磁珠/膜等方法。根据外泌体的大小，密度和表面标志物的不同进行分离，不同提取外泌体方法优劣势比较，受限于篇幅，详细版请联系维思克思生物科技获取。2.细胞培养上清中死细胞对外泌体分离的影响？在细胞凋亡/死亡过程中会释放大量Evs，会混入活细胞分泌的外泌体中，而目前的外泌体分离方法并不能将两者区分开来。所以在收集细胞培养上清样本时，需要保证细胞活率应不小于95%。3.大体积的样本类型，如何分离外泌体？大体积样本，如细胞培养上清、尿液等，可以先浓缩样本（如超滤或外泌体浓缩试剂等），减少样本体积，再使用常规的外泌体分离方法。4.复杂的样本类型，如何分离得到高纯度的外泌体？复杂的样本类型如血清、血浆、奶制品、脑脊液等，含有很多与外泌体在尺寸和密度接近的杂质，常规的外泌体分离方法难以获取高纯度的外泌体，建议使用亲和的外泌体分离方法，如PS亲和、免疫亲和、膜亲和等外泌体分离试剂盒。间充质干细胞EVs鉴定外泌体研究工具高灵敏度检测试剂，微量样本即可分析，减少样本用量需求。

你真的知道如何正确收集和保存EVs吗？样本的收集和保存是导致实验结果不确定性的一个重要来源。维思克思长期研究以及不断试错得出的“EVs样本收集和保存”经验，分享给各位外泌体研究者。血液。血液采集优先隔夜空腹。血浆通常是EVs的优先来源，因为在制备血清时凝块形成期间会释放额外的EVs。目前，血清的主要应用是研究miRNA。要制备血浆，血液需要抗凝。细胞培养上清分离EVs。污染EVs和可检测到的非EV组分的主要来源是培养基中的血清。如果细胞不能在无血清培养基中生长，获取的EVs将不再纯净，后续研究结果也将不准确。建议超速离心从血清中去除EVs或购买不含EV血清（WSC0020）；培养中监测细胞活率，确保大于90%，否则会释放凋亡小体和细胞碎片等其他囊泡，影响实验。WSR0020-3采用独特配方，可减少EVs的损耗；在动物实验中，无蛋白配方可明显降低毒性反应。冻存保护剂选型若需要进行冻干处理，选择WSR0020-3（冻干兼容）；若用于动物注射实验，选择WSR0020-3（无蛋白配方，低内）；若-80℃短期保存，选择WSR0020（经典款，性价比推荐）。

外泌体研究常见问题解答119.在分离过程中，外泌体含量会发生变化吗？准备的步骤越少，结果越好。很明显，即使你是一个非常熟练的操作员，将超离作为预富集步骤也会导致囊泡的损失。因此，即使囊泡的纯度很高，也无法控制哪些囊泡在处理过程中的丢失。10.为什么沉淀法或超速离心法提取的外泌体看不到沉淀？这种问题通常有三种可能性：1）使用的样本体积太小或外泌体含量太低。2）使用了不透明的超速离心管，一般来说外泌体产量都比较小，不透明管底很难见到明显沉淀的，可以当作有沉淀，继续往后操作即可。3）使用了粘附性低的耗材。部分角转管壁粘附性很低，沉淀很难富集或沉淀很容易滑落，请圆底离心管离心。11.外泌体和微囊泡可以分开提取吗？外泌体和微囊泡无法明确区分二者，所以无法完全分开。维思克思推荐使用下列简便方法：提取外泌体等粒子直径小的细胞外囊泡时，请选用10000g离心后的上清样品；提取含微囊泡在内的大粒子直径的细胞外囊泡时，首先要回收1200g离心的上清，然后将其10,000g离心分离获得的沉淀用PBS悬浮后作为样品使用。同时提取上述两种细胞外囊泡，请使用1200g离心分离的上清作为样品。外泌体研究工具主要技术自主研发，持续迭代升级，提升研究价值。

外泌体样本量太大怎么办？外泌体来源，几乎所有细胞都可以分泌外泌体。在科研中，如何处理大体积外泌体样本是众多研究者都觉得十分棘手的问题。目前，常用的分离手段包括超速离心法、尺寸排阻法、沉淀法以及免疫亲和法。然而这些分离方法要么只适用于小体积微量样本，要么就是对仪器要求高、操作复杂。与各位研究者分享维思克思的大体积样本处理经验，愿能为各位研究者提供思路。1.外泌体浓缩试剂。外泌体浓缩试剂可用于大体积外泌体样本的处理，可以高通量、快速实现大体积外泌体样本（如细胞培养上清、尿液等）的浓缩，浓缩后的样本后处理后可进行外泌体的分离纯化、RNA提取、蛋白提取等后续实验。2.超滤管超滤。超滤浓缩是一种常用的分离技术，利用超滤膜对组分进行分离。溶液通过超滤膜，利用膜孔的大小选择性，将分子量较大的物质过滤出来，而将分子量较小的物质通过膜孔。以上大体积外泌体样本处理工具，维思克思均有提供。外泌体浓缩试剂以及超滤管在处理大体积样本上具有突出优势。尤其是外泌体浓缩试剂，操作简便，浓缩倍数高，实验体验有较好的评价，推荐指数较高。浓缩后的外泌体分离纯化，维思克思产品线也非常齐全，包括磁珠法、SEC法等。外泌体研究工具高兼容性配方，适配多种样本类型，提升应用范围。尿液Extracellular Vesicles厂家供应

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外泌体表征与定量难在什么地方？又该怎么做？我们拜访过很多外泌体研究工作者，其中谈到多的是外泌体难以分离，分离后的外泌体不好定量，定量的外泌体数据是否准确等问题。2.单一表征方法的局限性对外泌体的纯度表征目前采用的是外泌体阴性蛋白标志、颗粒蛋白比。外泌体阴性蛋白标志一般采用WB检测，属于定性检测，与样本处理、抗体、显色、曝光时间等多个因素有关，如果作为纯度表征的指标，显然是不合适的。在蛋白聚集体或其他杂质（糖/脂质/核酸等）聚集体/大颗粒较多时，颗粒蛋白比的数值也可能较大，其作为纯度表征指标也有其局限性。既然上述外泌体定量方法、表征方法具有其局限性，那么如何科学的对外泌体进行定量和表征呢？工程化外泌体供应商

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