多束扫描技术可以同时对神经元组织的不同位置进行成像对两个远距离(相距大于1-2mm)的成像部位,通常使用两条单独的路径进行成像;对于相邻区域,通常使用单个物镜的多光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰问题,这个问题可以通过事后光源分离方法或时空复用方法来解决。事后光源分离方法指的是用算法来分离光束消除串扰;时空复用方法指的是同时使用多个激发光束,每个光束的脉冲在时间上延迟,这样就可以暂时分离被不同光束激发的单个荧光信号。引入越多路光束就可以对越多的神经元进行成像,但是多路光束会导致荧光衰减时间的重叠增加,从而限制了区分信号源的能力;并且多路复用对电子设备的工作速率有很高的要求;大量的光束也需要更高的激光功率来维持近似单光束的信噪比,这会容易导致组织损伤。使用双光子显微镜观察标本的时候,只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。美国bruker多光子显微镜Ultima Investigator
细胞在受到外界刺激时,随着刺激时间的增长,即使刺激继续存在,Ca2+荧光信号不但不会继续增强,反而会减弱,直至恢复到未加刺激物时的水平。对于细胞受精过程中Ca2+荧光信号的变化情况,研究发现,配了在粘着过程中,Ca2+荧光信号未发生任何变化,而配子之间发生融合作用时,Ca2+荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值,并可持续几分钟。这些现象,对研究受精发育的早期信号及Ca2+在卵细胞和受精卵的发育过程中的作用具有重要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等,Ca2+荧光信号强度也会发生很强的变化。美国清醒动物多光子显微镜供应商高能短脉冲激光,多光子显微镜实现超快、超高清成像速度。
单光子激发荧光和双光子激发荧光,是从荧光产生的机理上来区分的。而共焦则是荧光显微镜的一种结构,其目的是为了,通过共焦结构,提高整个荧光显微镜的空间分辨率。所以共焦荧光显微镜可以根据激发光源的不同,实现单光子共焦荧光成像或者双光子共焦荧光成像。往往一个普通的双光子荧光显微镜(没有共焦结构)其空间分辨率也可以达到单光子共焦荧光显微镜的水平。这样就可以简化整个系统,相对来说,就提高了激发光源的利用率,以及荧光的探测效率,这个也是我们提倡双光子荧光成像的原因之一。双光子荧光共焦显微镜由于双光子效应和共焦结构,分辨率则会更高,而我们通常说的共焦显微镜都是指单光子激发荧光的。
2020年,TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM轴向扫描速度的方法[2]。在光学显微镜中,物镜或样品缓慢的轴向扫描速度限制了体成像的速度。近年来,通过使用远程聚焦技术或电调谐透镜(ETL)已经实现了快速轴向扫描。但远程对焦时对反射镜的机械驱动会限制轴向扫描速度,ETL会引入球差和高阶像差,无法进行高分辨率成像。为了克服这些限制,该小组引入了一种新的光学设计,可以将横向扫描转换为无球面像差的轴向扫描,以实现高分辨率成像。有两种方法可以实现这种设计。***个可以执行离散的轴向扫描,另一个可以执行连续的轴向扫描。如图3a所示,特定装置由两个垂直臂组成,每个臂具有4F望远镜和物镜。远程聚焦臂由振镜扫描镜(GSM)和空气物镜(OBJ1)组成,另一个臂(称为照明臂)由浸没物镜(OBJ2)组成。两个臂对齐,使得GSM与两个物镜的后焦平面共轭。准直后的激光束经偏振分束器反射进入远程聚焦臂,由GSM进行扫描,使OBJ1产生的激光焦点可以进行水平扫描。多光子显微镜,实现无创、实时、动态的生物组织观测。
首代小型化双光子显微镜在国际上获得小鼠自由行为过程中大脑神经元和突触的动态图像后,我们成功研制了第二代小型化双光子显微镜。它具有更大的成像视野和三维成像能力,可以清晰稳定地对自由活动小鼠三维脑区的数千个神经元进行成像,实现对同一批神经元的一个月追踪记录。通过对微光学系统的重新设计系统的。微物镜工作距离延长至1mm,实现无创成像。内嵌可拆卸的快速轴向扫描模块,可采集深度180微米的3D体成像和多平面快速切换的实时成像。该扫描模块由一个快速的电动变焦透镜和一对中继透镜组成,在不同深度成像时可保持放大倍率恒定。其变焦模块重量,研究人员可根据实验需求自由拆卸。此外,新版微型化成像探头可整体即时拔插,极大地简化了实验操作,避免了长周期实验时对动物的干扰。在重复装卸探头同一批神经元时,视场旋转角小于,边界偏差小于35微米。突破传统光学成像极限,多光子显微镜适应各种复杂环境。美国清醒动物多光子显微镜供应商
多光子显微镜在生物医学研究中有广泛的应用,可以观察细胞内的亚细胞结构、蛋白质分布、细胞活动等。美国bruker多光子显微镜Ultima Investigator
对于双光子(2P)成像而言,离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素,而对于三光子(3P)成像这两个问题大大减小,但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多,所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高,它需要更快速的扫描,以便及时采样神经元活动;需要更高的脉冲能量,以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络,该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来,需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动,大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激,要想了解这种快速的神经元动力学,就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。美国bruker多光子显微镜Ultima Investigator