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qPCR第三方检测方法的分析验证有哪些内容？效率不仅是 PCR 效率，还包含反转录（Reverse transcription，RT）的效率。RT 效率是指 RNA 合成 cDNA 的效率，如果 1,000 个 RNA 分子变成 1,000 个 cDNA 分子，效率就是 100% ，实际上很多 RT 酶的效率对于不同浓度的 RNA 样本存在差异，这样 cDNA 扩增后的结果并不能真实反映样品中 RNA 的水平。PCR 效率是指 DNA 在扩增的每个循环中复制的效率，每个循环增加 2 倍，其效率就是 100% ，这也和所选试剂、引物、模板质量密切相关。梯度稀释实验得到的标准曲线可直观地显示各浓度理论值和测得的 Cq 值的相关性，其中 R2 值表示各个数据点是否正好落在标准曲线上，当 R2 < 0.98 时，表明数据偏差较大。
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“做miRNA下调，QPCR检测miRNA，表达水平无变化”，这到底是怎么回事？现有miRNA抑制手段，无论是基于载体构建的、还是化学合成的，本质上都是用跟成熟体互补的反义miRNA（miRNA海绵体属于不完全互补的反义RNA重复），其可以通过结合miRNA，阻断其与靶基因结合，但并不能有效引发miRNA的降解，原因有两方面：其一是反义RNA与miRNA结合后，序列很短，导致Dicer酶（细胞内降解双链RNA的主角）不能有效结合；其二是miRNA与Ago2以RISC复合物的形式存在，该复合物也会导致Dicer酶无法高效结合。因此，如果以反义RNA技术抑制miRNA功能，QPCR可以做，如果检测出表达水平下降还好，即便未检测到，也不表示抑制无效，正确的做法是直接检测目的基因蛋白水平是否有上调。但若实验者不清楚靶基因的情况下，不检测到miRNA下调，心里是没底的。成都血清测ELISA第三方检测公司推荐
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