外泌体示踪实验

外泌体的相关成分：1、外泌体的膜同细胞一样，是磷脂双分子层。2、外泌体膜含有MHC-1/2蛋白，能绑定特异性的肽链。3、外泌体膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。4、外泌体膜中有膜转运融合蛋白annexins、RAN、GTPases。5、外泌体膜上有脂质筏Chol、ceramide、SM、PC，限制膜流动，参与包括跨膜信号转导、物质内吞、脂质及蛋白定向分选的多种功能。6、外泌体中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA；同时还有一些蛋白、脂类也能被包裹到外泌体中。7、与外泌体产生相关的重要分子：Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。8、一些物质进行外泌体中是特异性的：如hnRNPA2B1能结合lncRNA或miRNA特异性的序列（GGAG/CCCU），进行主动包埋。超速离心是目前分离外泌体的主要技术。外泌体通过内体途径分泌到细胞外空间，并将各种生物活性分子（货物）转运至靶细胞。外泌体示踪实验

被特定部位的细胞获取的瘤子外泌体可为肉瘤的转移准备转移前微环境。用肺转倾向的肉瘤细胞来源的外泌体处理小鼠后可使骨转倾向的肉瘤细胞重新定向。外泌体的蛋白质组学分析发现不同部位倾向性的肉瘤细胞来源的外泌体具有不同的整合素（integrin）表达谱，整合素α6β4和α6β1与肺转有关，而整合素αvβ5与肝转有关。敲低整合素α6β4和αvβ5可减少外泌体被靶部位细胞获取，进而分别降低了肺和肝的转移。进一步研究发现外泌体整合素被细胞获取后活跃了Src的磷酸化和促炎的S100基因的表达。通过临床数据分析显示外泌体整合素可作为预测肉瘤转移的部位倾向性的诊断指标。外泌体的生物学功能外泌体产生于细胞中的多泡体。

细胞摄取诊疗性外泌体：从树突状细胞、成纤维细胞和间充质细胞中分离出的诊疗性外泌体可对靶细胞产生特定的作用，包括新抗原呈递、免疫调节和药物有效载荷传递。诊疗性外泌体对靶细胞的影响可能是通过不同的进入或相互作用机制来控制的。完整的外泌体的进入可能包括受体介导的内吞作用、网格蛋白包被小凹、脂筏、吞噬作用、小凹和大胞饮作用。外泌体内容物的进入或外泌体信号的诱导可能涉及配体受体诱导的细胞内信号或融合，从而将外泌体内容物沉积到细胞质中。近年来，随着外泌体研究的不断深入，它的应用已经涉及医学基础和免疫领域、寄生虫领域。

酶联免疫吸附测定（ELISA）：将其中一种针对外泌体表面抗原的抗体固定在微孔板的表面上，将外泌体样品暴露于含有固定抗体的孔中，由于抗体-抗原相互作用，表达抗原的外泌体将被捕获固定在板上。将未捕获的样品内容物洗掉，并使用另一种抗体检测固定的外泌体。ELISA已用于从尿液、血浆和血清中分离出外泌体，当使用标准液（已知外泌体的量）创建标准曲线时，甚至可以进行定量。但是，此方法需要通过超速离心或超滤对样品进行预处理。同样，流场-流分离与紫外线分析仪和光散射检测器相结合已被用于分析外泌体的大小和纯度。外泌体由各种类型的脂质和蛋白质组成，这些脂质和蛋白质衍生自形成外泌体的亲代细胞。

外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种囊泡（ExtracellularVesicles，EVs），其大小为30-150nm，具有双层膜结构和茶托状形态，含有丰富的内含物（包括核酸、蛋白和脂质等），参与细胞间的分子传递。外泌体普遍存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、唾液、尿液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。脑组织分离方法简述：将脑组织剪成薄片，放入离心管中加上消化液进行消化，经水浴、反复轻轻上下颠倒，再用移液间断缓慢吹吸至消化结束。随后加入培养基于消化液中，混匀，置于冰上。再进行一系列的差速超速离心过程，包括除杂、滤膜过滤、超离等。结尾用PBS重悬外泌体，用重悬后的外泌体进行下面的透射电镜（TEM）、纳米粒径追踪分子（NTA）和markerWB鉴定。外泌体的提取分离方法：PEG-base沉淀法。外泌体检测方法

超速离心是目前分离外泌体的主要技术。外泌体示踪实验

超速离心是外泌体提取较常用的方法也被认为是金标准，主要是根据外泌体的沉降系数、大小和形状将其分离出来。首先4℃低速离心（300-500g，10min）去除死细胞以及细胞碎片，随后以较高离心速度(2000xg，10min)去除生物聚合物以及凋亡小体，然后用10000xg,30min离心去除大型囊泡，结尾以超速离心沉淀外泌体。通过悬浮以及重复超速离心去除外泌体沉淀中的非外泌体蛋白。超速离心法具有操作简单、不易被分离试剂污染、获得的外泌体数量较多等优点。但是此方法需要昂贵的超高速离心机，每次处理的样本量较小，费时，电镜鉴定时还发现外泌体易聚集成块，且上清中仍能检测到大型囊泡，纯度不高，另外高速离心会损伤外泌体影响下游实验。外泌体示踪实验

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