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逆转录基本参数
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  • 苏州英泽生物医药科技有限公司
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  • 型号齐全
逆转录企业商机

逆转录的端粒复制:对于线性基因组,其滞后链的末端是无法完整复制的,每次约损失30-200个核苷酸(Cells.2020Feb22;9(2).)。这样随着细胞分裂,端粒会持续缩短,造成复制性衰老。对于大多数体细胞来说,端粒磨损是一种控制其分裂潜力的机制,但对于需要多次增殖的干细胞来说,必须设法维持端粒长度。端粒酶(telomerase)可以通过逆转录过程延长端粒。端粒酶由端粒酶RNA(TERC)和端粒酶逆转录酶(TERT)组成。TERT使用TERC作为模板,在染色体的单链末端合成端粒DNA的重复序列。大多数体细胞缺乏端粒酶活性,因而容易衰老。但未分化的生殖细胞,干细胞,活化的淋巴细胞和大多数疙瘩细胞具有高水平的端粒酶活性,可以克服端粒磨损并维持无限的细胞分裂。逆转录技术可以进行从RNA到DNA的转化,从而保护RNA序列的完整性。温州逆转录混合

反转录酶的用处:由它催化转录合成的DNA称为互补DNA(cDNA)。通常情况下,细胞内的转录应由DNA到RNA的,所得RNA为信使RNA(mRNA)供蛋白质合成作模板用。而在部分RNA病毒中,要实现自身扩增,必须具有DNA,因此先由RNA逆转录合成cDNA再由cDNA转录出RNA。逆转录酶可用RT—PCR,将RNA转变为DNA后扩增,以获得RNA的序列。1970年从致死RNA病毒中发现了反转录酶,并认为此酶与病毒的致死性质有关。反转录酶也分布于某些正常细胞和胚胎细胞。反转录酶的发现表明不能把生物的遗传信息由DNA→mRNA→蛋白质非常化,遗传信息也可以从RNA传递到DNA。它促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究,已成为研究这些学科的有力工具。深圳快速逆转录试剂研发逆转录实验尽量避免多次冻融处理RNA样品,避免样品质量下降。

逆转录实验步骤:引物浓度计算方法:(新合成的引物的稀释)假如终浓度为XuM(pmol/ul)加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)。用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)1、准备0.65mlEP管。2、加入4.5ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA。3、稍离心,100℃沸水裕1min。4、加入0.5uldNTP,2ul5×Buffer,1ulAMV逆转录酶。5、稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT。6、100℃沸水裕3min灭活AMV。7、立即PCR或-20℃保存。逆转录实验时注意事项:为避免RNA酶污染,在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。

RNA逆转录实验注意事项:RNA定量:除了掌握RNA的完整性之外,反转录之前还需要对RNA浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求,建议totalRNA上样量小于5μg。超过这个范围,会使反转录产物产生偏好性(表达丰度高的基因优先被反转录)而造成定量结果不准确。逆转录引物的选择:逆转录引物一般包含3种:oligodT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。逆转录实验过程中避免光照,防止RNA样品和试剂受光降解或刺激。逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择。

逆转录的转录过程:基因的转录是由RNA聚合酶催化进行的。基因的上游具有结合RNA聚合酶的区域,叫作启动子。启动子是一段具有特定序列的DNA,具有和RNA聚合酶特异性结合的位点,决定了基因转录的起始位点。RNA聚合酶与启动子结合后,在特定区域将DNA双螺旋两条链之间的氢键断开,使DNA解旋,形成单链区,以非编码链为模板合成RNA互补链的过程就开始了。转录的延长是以前面核苷酸的3′-OH为基础逐个加入NTP,形成磷酸二酯键,使RNA逐步从5′向3′端延伸的过程。在原核生物中,因为没有核膜的分隔,转录未完成即已开始翻译,而且在同一个DNA模板上同时进行多个转录过程。电镜下看到的羽毛状图形和羽毛上的小黑点(多聚核糖体),是转录和翻译高效率的直观表现。逆转录实验可以选择加入RNA合成抑制剂RNAse防止RNA降解和污染。深圳快速逆转录试剂研发

逆转录实验反应过程中需控制反应温度,时间和pH值等指标。温州逆转录混合

逆转录是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。逆转录PCR是将RNA的逆转录(reversetranscription)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术,故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。逆转录PCR实验原理是,提取组织或细胞中的总RNA,以RNA为模板,利用逆转录酶反转录成cDNA,再以cDNA链为模板进行PCR扩增,从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。RNA逆转录实验注意事项:选择合适的引物:随机引物法逆转录产生的片段较小,很难得到全长转录本的cDNA。单独选择某一种引物,实验可能都不完美,具体需要根据实验目的来确定。温州逆转录混合

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