盐城cDNA合成逆转录

逆转录酶的质量控制：1.切口酶：在与200单位酶37oC保温60分钟后，超螺旋质粒保留在90%以上。2.DNase测定：200单位酶与50ng3H-DNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于1%。3.RNase测定：200单位酶与50ng3H-RNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于3%。4.首先链cDNA的反应：在标准化的反应中，200单位酶催化从1mg1.2kbRNA或1mg7.5kbRNA将同位素掺入到cDNA中，通过放射自显影，对于1.2kb的RNA，产物cDNA是单一的、全长的条带。对于7.5kb的RNA产物有部分是全长的条带。用这二种RNA放射性转换到cDNA中有12%。5.RNaseH活性：200单位酶与polyA:polydT37oC保温60分钟，释放出的放射性要低于1%。逆转录实验避免RNA样品的过冻、过热处理，影响逆转录反应的效果。盐城cDNA合成逆转录

反转录酶的选择：反转录酶（Reversetranscriptase）又称逆转录酶。是以RNA为模板指导dNTP合成互补DNA（cDNA）的酶。一部分反转录酶具有RNA酶活性，能够在转录后降解RNA-DNA杂交链中的RNA链。如果反转录酶没有Rnase酶活性，可加入RNaseH来获得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶。依据RT-PCR，理想的状态下是选择具有较高热稳定性的反转录酶，cDNA的合成才能在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的RNA，并确保在整个反应过程中的全部活性，从而得到质量更高的cDNA。彩色逆转录混合逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择。

反转录酶的注意事项，引物的选择，OligodT：选择OligodT时，要求RNA必须有PolyA，所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT，所以对RNA样品的质量要求较高，较好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。特异性引物：特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT，引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以按照说明书按照一个温度做不是较佳选择，一般不推荐。

miRNA逆转录茎环法：首先需要进行RNA样品制备，可选的方法有：离心柱法抽提（不必去除gDNA）；传统Trizol法抽提（需要去除gDNA）。miRNA正向引物：需要分别设计。是否采用通用引物视情况而定，正向引物与通用反向引物不会形成二聚体时才能用。取200ul的PCR管，根据所得每组RNA的浓度C，每孔加入1000ng总RNA，按公式1000ng/C计算出所需RNA的体积x。然后按建议的20μL反应体系说明，依次向200μL的PCR管内加入下列试剂：加样结束后，移液器吹打混匀，低速离心数秒。将逆转录PCR管放入PCR扩增仪内，调整参数：37℃15min（反转录反应），85℃5s（反转录酶的失活反应），4℃∞。反应结束后根据实验需要进行荧光定量PCR或放入-20℃冰箱保存。说明：此处可以选择U6下游引物作为U6的逆转录引物，注意相应地调整无酶水的体积和反应温度。质粒RNA检测中的逆转录反应需要特定反应体系。

逆转录时试剂没混匀会怎么样？会出现起泡现象。RT-PCR的试剂都应在冰上融化，等完全融化后再取；用过的试剂应瞬间离心后放回-20℃保存；试剂应按顺序加，加完后再混匀离心。使用ReverTra-Ace、RNase-Inhibitor等酶类时，没有混匀，会出现起泡现象；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。miRNA的RT-PCR:1）引物稀释：miRNARTPrimer储存液浓度：10μM。miRNARTPrimer工作液浓度：2μM。RTPrimer工作液配置：5μLRT-primer储存液+45μLDEPC水。miRNA前后引物的工作液（10μM）用储存液（100μM）稀释后分装，放入-20℃冰箱保存，避免反复冻融。实时荧光PCR检测需要经过逆转录反应。彩色逆转录混合

逆转录实验在反应前应将各反应试剂混匀，避免试剂沉淀或剪切。盐城cDNA合成逆转录

逆转录酶实验一步法与两步法具有以下区别：一步法比两步法更快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR反应的错配率；两步法的优势在于中间产物cDNA，便于保存；且第二步PCR只取逆转录反应产物的1/10进行反应，有利于PCR条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第二步PCR反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法包括首先链cDNA合成和随后的PCR反应，容易产生污染问题；两步法的实验预算要低于一步法。盐城cDNA合成逆转录

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