臻准数字PCR

数字聚合酶链式反应（digitalpolymerchainreaction，dPCR）技术因具有高灵敏度、受基质干扰少等优势而被广用于转基因食品检测。本研究综述了数字PCR技术的原理、系统各部件的优劣势，梳理了数字PCR技术在转基因检测与溯源技术（标准物质）方面的进展和发展趋势，以期为转基因食品检测领域提供参考依据。dPCR的扩增过程大致上可以分为3步：样品的分散、样品的热循环扩增和样品的检测。对于数字PCR仪器系统，各个部件之间仍然有较大的改进空间，要发挥部件之间的协同作用是很重要的，而且有持续研究的价值。表1中总结了部分常见的数字PCR系统的类型，以及相对在硬件、便携性、性价比和自动化程度上的比较。数字PCR等新兴技术要在临床应用上得到爆发式增长，有赖于LDT市场的放开。臻准数字PCR

在使用dPCR进行转基因检测时，通常直接参照qPCR的方法。使用不同技术对相同样品检测时，两种方法的灵敏度是否具有可比性成为关注的问题。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板，每板765个微单元）芯片数字PCR分析仪测定标准物质ERM-AD413检测转基因玉米MON810。该小组应用dPCR技术评估在qPCR定义下的灵敏度数值，在拷贝数200-700之间，dPCR与qPCR的测量结果具有一致性。但与qPCR的灵敏度相比，dPCR在低于拷贝数200时有被低估的风险，在高于拷贝数1000时有被高估的风险。dPCR在同一阵列上同时测量转基因和内源性靶点时，需要稀释内源性靶点和转基因靶点在合理拷贝数范围内以保证dPCR测量结果的准确性。德国双螺旋生物仪器数字PCR分析应用3D数字PCR是基于纳米流体芯片进行检测，通过一次检测，将样品分到数千个单独的PCR。

无创产前筛查有望成为数字PCR在临床快速落地的锏应用。首先，无创产前筛查领域对于兼顾成本、准确性、速度的创新技术的需求还未满足。其次，无创产前筛查市场空间庞大，虽说中国每年新生儿的增长速度正在放缓，但每年仍有超过1000万的新生儿，带来了巨大的想象空间。2022年6月，郑大一附院遗传与产前诊断中心、塔歌生物联合在JournalofTranslationalMedicine（影响因子5.531）杂志上发表文章，验证了数字PCR作为T21,T18和T13产前筛查方法的可行性，这是世界上报道在真实临床条件下通过盲检实现一管反应可从孕妇血浆样本中同时检测出T21、T18和T13的数字PCR无创产前筛查试剂盒。文章显示，塔歌生物胎儿染色体非整倍体无创产前筛查数字PCR试剂盒总体筛查的灵敏度为100%，特异性为95.12%，均优于血清学筛查。除准确率高之外，塔歌生物的产品还拥有成本低、操作简便，及检测速度快等优势，可以加速无创产前筛查在各级医院，特别是基层地区普遍落地，助力中国出生缺陷防控。

数字PCR的引物和探针设计规则同荧光定量PCR是类似的，具体规则如下：1、查找和选择目标序列设计引物和探针的第一步是得到感兴趣基因的核酸序列。找到基因保守区域：基因的保守区域是指来自同一属/种/亚型的、在某个基因上碱基序列差别很小或没有差别的区域。根据需要，使用ClustalX或ClustalW等软件对齐属于同一属/种/亚型的基因的一组序列，在对齐序列的保守区域设计引物，并确保引物结合位点处的保守序列与其它非待检测的属/种/亚型的碱基序列具有较大的差异。扩增产物长度（AmpliconLength）：可在75-200bp之间（产物长度=下游引物位置-上游引物位置+1）。数字PCR在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。

产物越短，往往扩增效率越高。模板二级结构（Templatesecondarystructure）：PCR变性中和变性后的单链DNA不够稳定，容易自发折叠形成二级结构。应避免可形成稳定二级结构的模板链区域，因为如果模板链形成的二级结构在退火温度下稳定存在，定位在模板链二级结构处的引物将无法同模板链相结合。使用mfold可预测引物待结合的区域是否存在复杂的二级结构。设计引物时，尽量使引物定位在模板二级结构以外的序列上。避免具有4个以上相同的连续碱基的区域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸阶段聚合酶“滑动（PolymeraseSlippage）”。选择GC含量（GCContent）在50-60%之间的区域。如果高GC含量区域不可避免，可以尝试提高退火温度，并使用添加剂，例如甘油，检测结果部分为阳性，部分为阴性，之后进行分子数统计，不需做标曲。上海锐讯数字PCR市场前景

数字PCR主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法。臻准数字PCR

由于现有的商业化数字PCR设备在物理上只设置了2个检测通道，所以存在一个明显的短板：不能同时进行多个位点的检测。在样品多位点的检测中，就需要更多的起始样品，但临床上组织的样品非常有限。相比之下荧光定量PCR仪上就很容易实现多重检测。为了考察利用数字PCR实现多重检测的可能性，英国TheInstituteofCancerResearch的研究人员以非小细胞肺相关的KRAS基因为检测对象，在Bio-Rad的数字PCR系统上通过3个三重ddPCR检测体系来实现9个KRAS突变位点的检测。臻准数字PCR

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