美国国产数字PCR

在定量PCR时，我们常常纠结一个问题，究竟是相对定量还是***定量呢？如今，你无需纠结了，因为数字PCR（digitalPCR）来了。尽管这两种技术有些类似，都是估计起始样品中的核酸量，但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的***定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。在使用dPCR进行转基因检测时，通常直接参照qPCR的方法。美国国产数字PCR

基于微滴的QX100dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析。2012年RainDance公司推出了RainDropdPCR仪，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液。数字PCR就形成了2大派别，芯片式和微滴式。不论是哪种数字PCR，其原理都是有限稀释，终点PCR和泊松分布。将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成几万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行定量。美国赛默飞数字PCR解决方案数字PCR是直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的定量。

产物越短，往往扩增效率越高。模板二级结构（Templatesecondarystructure）：PCR变性中和变性后的单链DNA不够稳定，容易自发折叠形成二级结构。应避免可形成稳定二级结构的模板链区域，因为如果模板链形成的二级结构在退火温度下稳定存在，定位在模板链二级结构处的引物将无法同模板链相结合。使用mfold可预测引物待结合的区域是否存在复杂的二级结构。设计引物时，尽量使引物定位在模板二级结构以外的序列上。避免具有4个以上相同的连续碱基的区域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸阶段聚合酶“滑动（PolymeraseSlippage）”。选择GC含量（GCContent）在50-60%之间的区域。如果高GC含量区域不可避免，可以尝试提高退火温度，并使用添加剂，例如甘油，

了解泊松分布，我们先要从二项式分布说起，二项式分布是一个离散概率分布，它给出了m次试验中k次成功的可能性，每次试验的概率为p，例如当掷骰子时，二项分布给出了在10次试验中恰好有7次掷出4的概率。在数字PCR的情况中，投掷骰子类似于将一个目标实体随机“投掷”到一组分区中，当目标落在选定的分区中时，就是成功。如果有n个分区，并且分区过程是完全随机的，则目标出现在所选分区中的概率为1/n。该试验重复m次，样品中的每个分子一次。如下所示的二项式分布给出了k个成功的概率，即所选分区恰好包含k个分子的概率。数字PCR通常采用大量分区。当n很大，并且尝试成功的概率(1/n)很小时，二项分布可以近似为泊松分布。数字PCR作为研发阶段的验证方案之一。

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数字PCR主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法。美国国产数字PCR

PCR常使用目标序列的拷贝数或某一给定样品中转基因的百分比来体现方法灵敏度。由于qPCR和dPCR实验过程所用试剂的兼容性较好，在使用dPCR进行转基因检测时，通常直接参照qPCR的方法。使用不同技术对相同样品检测时，两种方法的灵敏度是否具有可比性成为关注的问题。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板，每板765个微单元）芯片数字PCR分析仪测定标准物质ERM-AD413检测转基因玉米MON810。该小组应用dPCR技术评估在qPCR定义下的灵敏度数值，在拷贝数200-700之间，dPCR与qPCR的测量结果具有一致性。但与qPCR的灵敏度相比，dPCR在低于拷贝数200时有被低估的风险，在高于拷贝数1000时有被高估的风险。dPCR在同一阵列上同时测量转基因和内源性靶点时，需要稀释内源性靶点和转基因靶点在合理拷贝数范围内以保证dPCR测量结果的准确性。美国国产数字PCR

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