武汉原代细胞分离试剂盒厂家供应

原代细胞传代培养方法：1.当细胞达到80-90%融合时需要传代培养。2.提前准备好多聚赖氨酸（PLL，货号0403）或纤维粘连蛋白（BPF，货号8248）包被好的培养瓶。3.将完全培养基，胰酶/EDTA消化液（T/E，货号0103），胰胰中和液（TNS，货号0113）和不含钙镁离子的DPBS（货号0303）加热至室温。我们不推荐用37度水浴加热试剂和培养基。4.用DPBS冲洗细胞。5.以T-75培养瓶为例，向培养瓶中加入8mlDPBS，然后加入2ml胰酶/EDTA消化液。轻轻摇动培养瓶保证细胞被胰酶/EDTA消化液完全覆盖。将培养瓶置于37度培养箱1-2分钟直到细胞变圆。在显微镜下观察细胞形态变化。6.在消化期间，准备一支50ml离心管加入5ml胎牛血清（FBS，货号0500）细胞培养过程中，多久更换一次培养基这取决于细胞生长的速度。武汉原代细胞分离试剂盒厂家供应

原代细胞与细胞系该如何选：原代细胞生长缓慢，一般认为，原代细胞培养的第1代和传代到第10代以内统称为原代培养。原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40-50代，这种传代细胞叫做细胞株。当细胞传至50代以后又会出现“危机”，这时有部分细胞的遗传物质发生了改变且带有变的特点，从而可能无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。北京正规原代细胞分离试剂盒厂家现货能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛。

原代细胞的小知识：1.解冻原代细胞对解冻过程非常敏感，因此将小瓶置于37℃水浴锅中，保持并轻轻旋转直到内容物刚刚解冻是很重要的。然后应立即从水浴中取出小瓶，并转移到无菌操作台。确保您的培养瓶在解冻前已经准备就绪，以便可以立即用于接种细胞，并置于培养箱中，我们在使用cellsystems的原代视网膜内皮细胞时，复苏的时候没有去离心，第二天换个液就可以。2.传代原代细胞有间隙克制接触不良反应，所以细胞不能到达100%的密度的时候传代，一般较有效的建议观察细胞的生长周期，CellSystems的原代细胞在细胞密度达到85%左右的时候传代较佳，当生长至100％汇合时，它就会衰老。记住，所有的原代细胞不是100％纯，因此我们要尽量减少污染细胞的生长。当细胞传代时，使用低浓度的胰蛋白酶，也可以尝试下cellsystems的整体消化套装哦（品牌：cellsystems，货号：4Z0-800）并在显微镜下密切监测细胞。此外，记得在胰蛋白酶消化后完全中和细胞中的胰酶，因为任何活性的胰蛋白酶都将损伤细胞

原代细胞标准化培养：由于每种原代细胞培养的条件迥异，而且每个实验室都摸索出自己的培养条件，而对于一个特定的组织块，所用培养条件不一样，得出的所需细胞族群就不一样，因为每种组织块都含有不同种类的细胞群，而每一种细胞群在所选定的培养条件下（比如所选蛋白分解酶的种类和条件，细胞因子的种类，基础培养基的种类或者是培养时间长短）都会得出不同的结果。由于各实验室采取不同的培养条件，即使是同一块心组织就有可能造成A实验室获得30%的心肌细胞，70%其他种类细胞，而B实验室却能获得70%所需心肌细胞，30%为成纤维、脂肪等种类。这样的话，即使是做同一项目的实验，就有可能得出相反的科学结论。因此，早在2004年，美国科学界就质疑之前以原代细胞为主的科研文章，并同时提出原代细胞标准化培养的概念。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。

原代细胞转染操作步骤（以24孔培养板为例）：A.细胞接种：转染前现在接种细胞，每孔500μl培养基（不可加物品），使细胞在转染时密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物准备：1.6pmolsiRNA用50μl无血清培养基稀释。2.2μlRFectPM用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25min内执行第三步操作，不要过于延迟。3.孵育5min后，将siRNA稀释液与RFectPM稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20min。C.将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：1.将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。2.37°C培养18-72h，检测基因克制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定较佳孵育时间。转染实验优化:为了提高转染效率，较好对转染条件进行优化，特别是开始使用。它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。北京正规原代细胞分离试剂盒厂家现货

很适合用于药物测试、细胞分化和转化等实验研究。武汉原代细胞分离试剂盒厂家供应

细胞培养注意事项及常见问题解答：1、培养基的选择依细胞种类而定。如果是从别的实验室借来的细胞，较初阶段一定要保持细胞原有的培养条件；特殊种类的细胞，比如内皮细胞，可以借鉴网上培养成功的条件，添加一些特定成分。2、液体培养基的保存条件应是冰箱4度冷藏。小六儿见过有的大实验室细胞量多，一次性购买的培养基瓶数也多，有些人可能觉得-20冰箱保存时间会更久一些。但是经过冷冻后的培养基再溶化时，你会发现培养基的颜色发生变化，颜色变深，这就是培养基的PH值升高了。3、培养基中都含有大量的谷氨酰胺，用来合成细胞生长所需要的核酸和蛋白质。但是谷氨酰胺在溶液中不稳定，保存4周后的培养基需要重新加入谷氨酰胺。所以尽量不要大批量购买培养，也不要一次配太多的培养基。武汉原代细胞分离试剂盒厂家供应